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哺乳动物细胞表达的难点和解决方案,都帮你整理好了
点击次数:55 发布时间:2018-08-07

我们将着重介绍 Strep-tag® 在哺乳类细胞表达系统的应用。

 

虽然大肠杆菌 E.coli 表达系统经济实惠,但由于缺乏重要的脂类,分子螫合物,以及重要的翻译后修饰,用它表达真核蛋白,可能会影响蛋白本身的折叠及功能,以膜蛋白为例,大肠杆菌表达系统能影响目标蛋白在细胞膜的插入位置、及其应有的功能[1]。除此之外,当目标蛋白大于 50kDa 时,使用大肠杆菌系统可能表达出不完整的蛋白[2]

 

所以,为了研究特定蛋白的功能(如:信号通路)、生产较大型的蛋白,或进行高解析度的结构分析,愈来愈多的实验组选择哺乳类表达系统来生产融合蛋白。其原因为哺乳动物细胞生产出的重组蛋白与人类蛋白十分相似,有较完整的蛋白折叠、组合及翻译后修饰[3]。因此,愈来愈多科学家们更加关注于—如何从哺乳类细胞中高效的纯化目标蛋白。

 

1

亲和标签的选择

 

首先,需考虑选择合适的亲和标签。常用于哺乳动物表达系统的亲和标签有 His-tag、FLAG-tag、GST-tag及 Strep-tag® 等[4-12],整理于下表:

 

(点击放大查看)

 

这些亲和标签在使用上各有千秋。

 

使用 His-tag 时,常遇到的问题是寄主蛋白与填料的非特异性结合,在哺乳动物重组蛋白的纯化过程中,这样的情况更为明显。由于系统中有很多含有组氨酸(histidine)的残基的蛋白,这种蛋白结构与 his-tag 相似,容易与镍柱结合,因此导致目标蛋白纯度降低[13]

 

FLAG-tag 系统可在非变性条件下进行纯化,能得到高纯度、有活性的蛋白,但其缺点为纯化介质较为不稳定,且纯化成本高上许多[5]

 

另一常用的标签为 GST-tag,一个 26kDa 的蛋白,其特点是表达量高,具高度抗原性,常用来增加目标蛋白的溶解度,但常常会影响目标蛋白的特性,一般推荐纯化后将标签去除[8]

 

而 Strep-tag®(包含 Strep-tag®II或是 Twin-Strep-tag®),都是短肽标签,分别为 8 或 28 个胺基酸,一般不干扰蛋白折叠或活性,因此适合用于蛋白功能性研究[5]。Strep-tag® 可以特异性的结合在 Strep-Tactin® (二代介质) 或 Strep-Tactin®XT (三代介质) 的生物素的结合位点。洗脱时使用的脱硫生物素(适用于二代)或生物素(三代),对同样的结合位点有更高的亲和力,能将目标蛋白从同样位置移除,因此得到的目标蛋白纯度一般高于 95%[12]

 

同时,三代 Strep-Tactin®XT 与 Strep-tag® 蛋白的亲和力大幅提升,直接加入含目标蛋白的哺乳细胞的培养上清,即可高效纯化出所需蛋白(注: 原本使用二代需先以 Avidin 或是 BioLock 将培养基中的生物素遮蔽,才不会影响纯化表现)。

 

2

三代 Strep-Tactin®XT 亲和力显著

 

图 A 比较了 His-tag 与 Strep-tag® 直接加入哺乳细胞培养上清的纯化目标蛋白的表现。

 

图 A

 

图 A:分别向 Strep-Tactin®XT High Capacity 1ml 重力柱(左)和 Ni-NTA 1ml 重力柱(右)中,同时加入含 4mg mCherry-Twin-Strep-tag (TST) 或 mCherry-His-tag (His) 萤光蛋白的 ExpiCHO 细胞培养上清(注: 接下来的实验皆是取哺乳细胞表达某抗体后的上清,另加入高纯度目标蛋白进行实验)。由图可见,Strep-Tactin®XT(左)能高效率的捕捉 mCherry-TST,而右方的 mCherry-His 几乎无法挂柱。

 

此外,我们也测试了其他的蛋白,例如 SEAP (72 kDa) 或抗体 (mAb,其重链为 55 kDa)。图 B 为以 Strep-Tactin®XT 纯化 SEAP-TST、mCherry-TST与 mAb-TST 的 SDS-PAGE 分析结果,可见对于不同蛋白,Strep-tag® 系统都能纯化出高纯度的目标蛋白。(注: 红色标记处为 mCherry 的降解产物,非杂带)

 

图 B

 

因 Strep-Tactin®XT 与 Twin-Strep-tag 蛋白的高亲和力,即使目标蛋白的浓度低,使用 Strep-Tactin®XT 仍可以有效的捕捉上清中的目标蛋白。表 C 整理了几个实验的数据,显示当目标蛋白浓度低于 20 μl/ml 时,得率仍能达到几近 100%。

 

表 C

 

3

Strep-Tactin®XT 普适性高

 

除了上述实验所用的 CHO 细胞株外(中国仓鼠卵巢细胞),另一常用于生产蛋白的哺乳动物细胞株为 HEK293(人胚胎肾细胞),使用上较 CHO 简单。我们测试了 Strep-Tactin®XT 的纯化表现 : 表 D1 为以 Expi293 表达 SEAP-TST 或 mCherry-TST 蛋白后,目标蛋白的浓度。图 D2 为纯化表现的 SDS-PAGE 分析。从中可知,与 ExpiCHO 培养基相同,直接将表达好的 Expi293 上清加入 1 ml Strep-Tactin®XT 高载量重力柱中进行纯化,一样能够快速的得到高纯度的目标蛋白。

 

表 D1

 

图 D2

 

综上所述,Strep-tag® 非常适合用在哺乳动物细胞系中表达目标蛋白,其纯化过程也与常见的 ExpiCHO 及 Expi293 培养基相容,不须另外处理,让实验流程更为便利。加上 Strep-tag® 系统在纯度上的优势,是目前在这个应用上的绝佳选择。

 

 

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