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干货:原代脑微血管内皮细胞(BMEC)分离步骤
点击次数:196 发布时间:2018-08-22

最近一直在逛 dxy 的论坛,看看好多宝宝关于原代提取中都有疑问,这个是我们实验员在做原代脑微血管内皮细胞(BMEC)时,我这边做的一个实验记录及分离步骤,仅仅供大家参考。

一、实验材料:

SD 大鼠(4~6 周龄,雄性),大号手术剪,镊子,50 ml 离心管,6 孔板,75% 乙醇,生理盐水,胶原酶,25%BSA,多聚赖氨酸,DMEM/F12 基础培养基,DMEM/F12 完全培养基

二、实验仪器:

超净工作台,低速离心机,二氧化碳培养箱

三、实验步骤:

1. 将大鼠对大鼠实行 anlesi,浸泡在 75% 乙醇中约 1 min


 
2. 剪开头部皮肤,快速取出大脑,尽量保证完整性
 


3. 将大脑放入预冷的 DMEM/F12 基础培养基中
 


4. 在超净工作台中,去掉外层血痂,脑膜,外层血管(平皿上操作)
 


5. 去掉白质(松散状),保留灰质(贝壳状的左右脑)

6. 4 ℃ 预冷培养基多次清洗

7. 将大脑剪成 1 mm3 的块状,转移至无菌的 50 ml 离心管中,将块状大脑剪碎,移液枪吹打

8. 900 rpm 室温离心 4 min,弃去上清,然后添加 5 ml DMEM/F12 无血清培养基

  • 用移液枪吹打均匀,然后补加 10 ml 培养基,加 100 μL 胶原酶Ⅱ,37 ℃ 消化 30~45 min,同时用 1 ml 多聚赖氨酸包被 6 孔板。
  • 消化完成后加入培养基中和,900rpm 室温离心 10 min。
  • 直接加入 15 ml 25%BAS,2000rpm 室温离心 20 min。离心后离心管出现分层,下层深红色(少量)为脑微血管细胞。
  • 生理盐水轻轻冲洗 6 孔板中多余的多聚赖氨酸,冲洗 2 次。
  • 取下层脑微血管沉淀,加入生理盐水混匀,900rpm 室温离心 5 min。用新鲜 DMEM/F12 完全培养基将细胞重悬,重悬后转移至 6 孔板中培养。
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