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细胞培养技术大全
点击次数:93 发布时间:2018-10-30

细胞培养技术:指的是细胞在体外条件下的生长,在培养的过程中细胞不再形成组织(动物)。

 

定义

  培养物是单个细胞或细胞群。细胞在培养时都要生活在人工环境中,由于环境的改变,细胞的移动或受一些其他因素的影响,培养时间加长,传代导致细胞出现单一化型。

 

在现代医学和生物科学研究中应用广泛

优点

  1.直接观察活细胞的形态结构和生命活动。用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学 等多种学科研究.

 

  2.直接观察细胞的变化可便于摄影。

 

  3.研究细胞种类如低等到高等到人类、胚胎到成体、正常组织到肿瘤。

 

  4.便于使用各种技术:相差、荧光、电镜、组化、同位素标记等方法观察和研究细胞状况。

 

  5.是分子生物学和基因工程学的研究对象,也是其主要的组成部分。

 

  6.易于施用物理、化学生物的实验研究。

 

  7.易于提供大量生物性状相似的实验对象,耗资少比较经济。

 

  8.成为生物制品单克隆抗体生产和基因工程等的材料来源。

缺点

  组织和细胞离体后独立生存在人工的培养环境中,虽然模拟体内环境,仍有很大差异。 因而利用培养细胞做实验时,不应视为体内细胞完全相同,把实验结果推测体内,轻易做出与体内等同的结论。

细胞类型

  细胞类型根据是否附于支持物上生长的特性,分为: 贴附型 悬浮型

 

  (一)贴附型

 

  细胞贴附在支持物表面生长,只依赖贴附才能生长的细胞叫做贴附型细胞(Anchorrage-dependent cells)这种现象与细胞分化有关。

 

  贴附型细胞的分型

 

  1.成纤维型细胞:(fibroblast) 来自中胚层

 

  特点:与体内成纤维细胞形态相似,胞体梭型或不规则三角形,中央有圆形核,胞质向外伸出2~3个长短不同的突起。细胞在生长时呈放射状,漩涡或火焰状走行。

 

  起源:细胞来自中胚层间充质组织。

 

  除真正的成纤维细胞、心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮细胞。

 

  注意:细胞在培养时成为成纤维型细胞是一种惯称,与体内细胞不同。

 

  2.上皮型细胞(epithlium cell type) 来自外胚层 特点:扁平不规则多角型、圆形核、细胞紧密相连成细胞增殖数目增多时,整个上皮膜随之移动。边缘细胞很少脱离细胞群而单独活动“ 拉网”现象与起源内外胚层组织有关。

 

  组织: 皮肤表皮及其衍生物(汗腺、皮脂腺)消化道分上皮、肝、胰、肺泡上皮。

 

  3. 游走型细胞(wandering cell type)

 

  特点:在支持物上散在生长,不连接成片,胞质伸出伪足或突起呈活跃的游走或变形运动,速度快不规则, 密度大连接成片呈多角形不易与其他类型的细胞 区别。

 

  4. 多形型细胞 (polymorphic cell type)

 

  特点: 无规律的形态,如神经细胞。

 

  悬浮型细胞(suspended cell type)

 

  特点: 不贴附在支持物生长,胞体圆形,在培养液中生长空间大,可长时间的生长,繁殖旺盛便于做细胞代谢研究。S180肉瘤、血液里的白细胞、K562、 HL-60。

 

  分型的目的:

 

  方便描述细胞在培养过程中的形态变化。培养条件好时,细胞相对稳定,可反映出起源、正常异常的区别,作为判定细胞生物学性状指标。

 

  强调:一般形态并不是一项可靠指标要受各方面影响。

 

  如:反复开关温箱、温度、C02的浓度、培养基变碱、支原体、pH值。细胞在接种时呈三角型状态,经培养一定时间后,细胞在传代前已形成上皮型细胞。


细胞生长与增殖

  培养细胞的生存环境是培养瓶、器皿或其他容器,生存空间及营养是有限的。当细胞增殖到一定密度后,分离出一部分细胞和更新营养液,使细胞更好地生存,这一过程称之为“ 传代”(passage或subculture)。 值得注意的是:每次传代细胞在生长和增殖方面受到一定的影响

细胞生命期(life span of culture cells)

  指细胞在培养过程中持续增殖和生长的时间。一般根据细胞种类、性状和原供体的年龄的情况而定。

 

  如:二倍体成纤维细胞,在不冻存和反复传代条件下可传30~50代,相当于150~300个细胞增殖周期,能维持一年左右的生命,细胞便开始凋亡(apoptosis)。 细胞在生存过程中经历以下三个阶段

 

  1.原代培养期(primary culture)

 

  组织到第一次传代 时间大约为1~4周

 

  特点:

 

  细胞活跃移动,分裂,但不旺盛多呈二倍体核型。

 

  原代与体内原组织形态结构和功能活动基本相似。

 

  各细胞的遗传性状互不相关,细胞相互依存性强,如果把这种稀释分散成单细胞,在软琼脂培养基中进行培养细胞克隆的形成率(cloning efficiency)下降,表明细胞独立生存性差。

 

  2.传代期(passage)

 

  初代培养细胞一经传代便称之为细胞系(cell line)

 

  特点:

 

  细胞增殖旺盛,并维持二倍体核型,也叫二倍体细胞系(diploid cell line)为了保存二倍体细胞性质,细胞应在初代或传代早期冻存为好。

 

  一般细胞在10代以内冻存。

 

  冻存配方:

 

  向培养液加入保护剂二甲基亚砜(DMSO)或甘油,封入安瓶中。

 

  存于在液氮中温度可达到-196℃,可长期储存。如解冻后细胞复苏,仍能继续增殖生长,细胞性状不受影响,成为保存细胞最主要的手段。

 

  3.衰退期

 

  特点:细胞仍生存 增殖减慢 不增殖 轮廓增强 衰退凋亡

 

  注意:细胞在三期中的任何一期(一般发生在传代后期或衰退期)在某些因素影响下,如血清质量不佳、病毒污染、温度和pH不稳等,细胞可能发生自发转化(spontaneous transion);

 

  细胞可能获得永生性(immortality) 或称为恶性性(malignancy)。细胞获得持久性的增殖能力,这样的细胞群体称为连续细胞系(continuous cell line)。而细胞获得不死性后,细胞核型大多变成异倍体(heteroploid)接触抑制消失。

培养细胞一代生存期

  “ 一代”指细胞接种到分离再培养的所用的时间。与细胞倍增一代不是一个含义。在细胞一代中,细胞能倍增3~6次,经历三个阶段:

 

  1. 潜伏期(latent phase) :

 

  接种 经过 悬浮期(细胞质回缩,胞体呈圆球形) 贴壁。

 

  初代培养细胞 经过 10~24小时或更多时间。

 

  连续细胞系和癌细胞系 经过 10~30分钟 贴附。

 

  贴附现象是一个非常复杂和受多种因素的影响。

 

  影响细胞贴附:底物表面不干净,影响细胞贴附。

 

  利于细胞贴附:底物表面带有阳性物质与特殊物质:

 

  纤粘连蛋白(fibronectin FN)、

 

  细胞表面蛋白(cell surface proteinCSP)

 

  这些物质有的存在与细胞表面,有的来自血清。

 

  潜伏期特点:

 

  长短与细胞接种密度、种类、使用的培养基性质有关。

 

  (1)细胞贴附后进入潜伏期,细胞无增殖。少见分裂相,细胞有运动活动。

 

  (2)初代培养 细胞潜伏期约为24~96小时或更长,

 

  连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期约6~24小时。

 

  (3)细胞接种密度大潜伏期短。

 

  (4)细胞出现分裂相增多时,标志细胞进入指数增生期。

 

  2.指数增生期(logarithmic growth phase):

 

  特点:细胞增殖最旺盛阶段,分裂相增多。

 

  细胞分裂指数(mitotie index MI) :

 

  表示每1000个细胞中的分裂相数。

 

  条件:分裂相数与细胞种类、培养成分、pH培养箱温度有关。

 

  细胞分裂指数:

 

  初代细胞:在0.1%~0.5%之间% ,

 

  连续分裂细胞和肿瘤细胞:3 ~5%。

 

  指数增生期是作为细胞一代活力zui好的时期,是进行实验zui好和最主要的阶段。

 

  指数增生期持续3~5天,细胞数量增多后生长空间变小,细胞相互接触可连接成片。

 

  正常细胞:细胞相互接触能抑制细胞运动,这种现象称为接触抑制(contact inhibition)。

 

  肿瘤细胞:没有这种现象,可作为区别正常与肿瘤细胞的标志之一。当肿瘤细胞达到一定密度后向三维空间发展,使细胞发生堆积(piled up)。

 

  由于细胞不断增殖分裂,细胞数量持续增多,培养液的营养成分减少,代谢产物增多,细胞受营养的枯竭和代谢物的影响,则发生密度抑制(Density inhibition),导致细胞分裂停止。

 

  3.停滞期(stagnate phase)

 

  细胞量和密度达到饱和,细胞停滞增殖。表明细胞进入到停滞期,细胞数量持平,也称为平顶期(plateau)。

 

  特点:细胞不增殖,有代谢活动。培养液中的营养已逐渐耗尽,代谢产物积累增多,pH降低,此时需要传代,否则细胞将会中毒,发生形态改变,细胞会从底物脱落死亡。

 

  注意:

 

  传代过晚将影响下一代细胞的生长,至少要再传 1~2代 ,通过换液淘汰死细胞和受损较轻的细胞。待细胞全部恢复后再用。

 

  在这一点上要特别注意。

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